Микроорганизмы как объекты биотехнологии. Классификация. Характеристика.
Бактерии чрезвычайно разнообразны по условиям обитания, приспособляемости, типам питания и биоэнергообразования, по отношению к макроорганизмам - животным и растениям. Наиболее древние формы бактерий - архебактерии способны жить в экстремальных условиях (высокие температуры и давления, концентрированные растворы солей, кислые растворы). Эубактерии (типичные прокариоты, или бактерии) более чувствительны к условиям окружающей среды.
По типу питания бактерии делятся по источнику энергии:
· фототрофы, использующие энергию солнечного света;
· хемоавтотрофы, использующие энергию окисления неорганических веществ (соединений серы, метана, аммиака, нитритов, соединений двухвалентного железа и др.);
По типу окисления вещества:
· органотрофы, получающие энергию при разложении органических веществ до минеральных веществ; эти бактерии - основные участники круговорота углерода, к этой же группе относятся бактерии, использующие энергию брожения;
· литотрофы (неорганические вещества);
По типу источников углерода:
· гетеротрофные – используют органические вещества;
· афтотрофные – используют газ;
Для обозначения типа питания используется:
1. природа источника энергии фото- или хемо-;
2. Доноры электронов лито- или органо-;
3. Источники углерода афто- и гетеро-;
И заканчивается термин словами трофия. 8 различных типов питания.
Высшие животные и растение склоны к 2 типам питания:
1) Хемоорганогетеротрофия (животные)
2) Фотолитоафтотрофия (растения)
У микроорганизму представлены все типы питания при чем они могут переходить с одного на другой в зависимости от существования
Существует отдельный вид питания:
Бактерии являются удобным объектом для генетических исследований. Наиболее изученной и широко применяемой в генно-инженерных исследованиях является кишечная палочка Escherichia coli (Е. coli), обитающая в кишечнике человека.
Организация и структура биотехнологических производств. Отличительные особенности биотехнологического производства от традиционных видов технологий. Преимущества и недостатки биотехнологических производств по сравнению с традиционными технологиями.
Большое разнообразие биотехнологических процессов, нашедших промышленное применение, приводит к необходимости рассмотреть общие, наиболее важные проблемы, возникающие при создании любого биотехнологического производства. Процессы промышленной биотехнологии разделяют на 2 большие группы: производство биомассы и получение продуктов метаболизма. Однако такая классификация не отражает наиболее существенных с технологической точки зрения аспектов промышленных биотехнологических процессов. В этом плане необходимо рассматривать стадии биотехнологического производства, их сходство и различие в зависимости от конечной цели биотехнологического процесса.
Существует 5 стадий биотехнологического производства.
Две начальные стадии включают подготовку сырья и биологически действующего начала. В процессах инженерной энзимологии они обычно состоят из приготовления раствора субстрата с заданными свойствами (рН, температура, концентрация) и подготовки партии ферментного препарата данного типа, ферментного или иммобилизованного. При осуществлении микробиологического синтеза необходимы стадии приготовления питательной среды и поддержания чистой культуры, которая могла бы постоянно или по мере необходимости использоваться в процессе. Поддержание чистой культуры штамма-продуцента - главная задача любого микробиологического производства, поскольку высокоактивный, не претерпевший нежелательных изменений штамм может служить гарантией получения целевого продукта с заданными свойствами.
Третья стадия - стадия ферментации, на которой происходит образование целевого продукта. На этой стадии идет микробиологическое превращение компонентов питательной среды сначала в биомассу, затем, если это необходимо, в целевой метаболит.
На четвертом этапе из культуральной жидкости выделяют и очищают целевые продукты. Для промышленных микробиологических процессов характерно, как правило, образование очень разбавленных растворов и суспензий, содержащих, помимо целевого, большое количество других веществ. При этом приходится разделять смеси веществ очень близкой природы, находящихся в растворе в сравнимых концентрациях, весьма лабильных, легко подвергающихся термической деструкции.
Заключительная стадия биотехнологического производства - приготовление товарных форм продуктов. Общим свойством большинства продуктов микробиологического синтеза является их недостаточная стойкость к хранению, поскольку они склонны к разложению и в таком виде представляют прекрасную среду для развития посторонней микрофлоры. Это заставляет технологов принимать специальные меры для повышения сохранности препаратов промышленной биотехнологии. Кроме того, препараты для медицинских целей требуют специальных решений на стадии расфасовки и укупорки, так должны быть стерильными.
Основная цель биотехнологии - промышленное использование биологических процессов и агентов на основе получения высокоэффективных форм микроорганизмов, культур клеток и тканей растений и животных с заданными свойствами. Биотехнология возникла на стыке биологических, химических и технических наук.
Биотехнологический процесс - включает ряд этанов: подготовку объекта, его культивирование, выделение, очистку, модификацию и использование продуктов.
Биотехнологические процессы могут быть основаны на периодическом или непрерывном культивировании.
Во многих странах мира биотехнологии придается первостепенное значение. Это связано с тем, что биотехнология имеет ряд существенных преимуществ перед другими видами технологий, например, химической.
1). Это, прежде всего, низкая энергоемкость. Биотехнологические процессы совершаются при нормальном давлении и температурах 20-40° С.
2). Биотехпологическое производство чаще базируется на использовании стандартного однотипною оборудования. Однотипные ферменты применяются для производства аминокислот, витаминов; ферментов, антибиотиков.
3). Биотехнологические процессы несложно сделать безотходными. Микроорганизмы усваивают самые разнообразные субстраты, поэтому отходы одного какого-то производства можно превращать в ценные продукты с помощью микроорганизмов в ходе другого производства.
4). Безотходность биотехнологических производств делает их экологически наиболее чистыми
5). Исследования в области биотехонологии не требуют крупных капитальных вложений, для их проведения не нужна дорогостоящая аппаратура.
К первоочередным задачам современной биотехнологии относятся -создание и широкое освоение:
1)новых биологически активных веществ и лекарственных препаратов для медицины (интерферонов, инсулина, гормонов роста, антител);
2)микробиологических средств защиты растений от болезней и вредите
лей, бактериальных удобрений и регуляторов роста растений, новых высокопродуктивных и устойчивых к неблагоприятным факторам внешней среды гибридов сельскохозяйственных растений, полученных методами генетической и клеточной инженерии;
3)ценных кормовых добавок и биологически активных веществ (кормового белка, аминокислот, ферментов, витаминов, кормовых антибиотиков) для повышения продуктивности животноводства;
4)новых технологий получения хозяйственно-ценных продуктов для использования в пищевой, химической, микробиологической и других отраслях промышленности;
5)технологий глубокой и эффективной переработки сельскохозяйственных, промышленных и бытовых отходов, использования сточных вод и газовоздушных выбросов для получения биогаза и высококачественных удобрений.
Традиционная (обычная) технология представляет собой разработки, отражающие средний уровень производства, достигнутый большинством производителей продукции в данной отрасли. Такая технология не обеспечивает ее покупателю значительных технико-экономических преимуществ и качество продукции по сравнению с аналогичной продукцией ведущих производителей, и рассчитывать на дополнительную (сверх средней) прибыль в данном случае не приходится. Ее преимуществами для покупателя являются сравнительно невысокая стоимость и возможность приобретения проверенной в производственных условиях технологии. Традиционная технология создается, как правило, в результате устаревания и широкомасштабного распространения прогрессивной технологии. Продажа такой технологии обычно осуществляется по ценам, компенсирующим продавцу издержки на ее подготовку и получение средней прибыли.
Преимущества биотехнологических процессов по сравнению с химической технологией биотехнология имеет следующие основные преимущества:
·возможность получения специфичных и уникальных природных веществ, часть из которых (например, белки, ДНК) еще не удается получать путем химического синтеза;
·проведение биотехнологических процессов при относительно невысоких температурах и давлениях;
·микроорганизмы имеют значительно более высокие скорости роста и накопления клеточной массы, чем другие организмы
·в качестве сырья в процессах биотехнологии можно использовать дешевые отходы сельского хозяйства и промышленности;
·биотехнологические процессы по сравнению с химическими обычно более экологичны, имеют меньше вредных отходов, близки к протекающим в природе естественным процессам;
·как правило, технология и аппаратура в биотехнологических производствах более просты и дешевы.
Биотехнологическая стадия
Основной стадией является собственно биотехнологическая стадия, на которой с использованием того или иного биологического агента происходит преобразование сырья в тот или иной целевой продукт.
Обычно главной задачей биотехнологической стадии является получение определенного органического вещества.
Биотехнологическая стадия включает в себя:
Ферментация - процесс, осуществляемый с помощью культивирования микроорганизмов.
Биотрансформация - процесс изменения химической структуры вещества под действием ферментативной активности клеток микроорганизмов или готовых ферментов.
Биокатализ - химические превращения вещества, протекающие с использованием биокатализаторов-ферментов.
Биоокисление - потребление загрязняющих веществ с помощью микроорганизмов или ассоциации микроорганизмов в аэробных условиях.
Метановое брожение - переработка органических отходов с помощью ассоциации метаногенных микроорганизмов в анаэробных условиях.
Биокомпостирование - снижение содержания вредных органических веществ ассоциацией микроорганизмов в твердых отходах, которым придана специальная взрыхленная структура для обеспечения доступа воздуха и равномерного увлажнения.
Биосорбция - сорбция вредных примесей из газов или жидкостей микроорганизмами, обычно закрепленными на специальных твердых носителях.
Бактериальное выщелачивание - процесс перевода нерастворимых в воде соединений металлов в растворенное состояние под действием специальных микроорганизмов.
Биодеградация - деструкция вредных соединений под воздействием микроорганизмов-биодеструкторов.
Обычно биотехнологическая стадия имеет в качестве выходных потоков один жидкостной поток и один газовый, иногда только один - жидкостной. В случае, если процесс протекает в твердой фазе (например, созревание сыра или биокомпостирование отходов), выходом является поток переработанного твердого продукта.
Подготовительные стадии
Подготовительные стадии служат для приготовления и подготовки необходимых видов сырья биотехнологической стадии.
На стадии подготовки могут быть использованы следующие процессы.
Стерилизация среды - для асептических биотехнологических процессов, где нежелательно попадание посторонней микрофлоры.
Подготовка и стерилизация газов (обычно воздуха), необходимых для протекания биотехнологического процесса. Чаще всего подготовка воздуха заключается в очистке его от пыли и влаги, обеспечении требуемой температуры и очистке от присутствующих в воздухе микроорганизмов, включая споры.
Подготовка посевного материала. Очевидно, что для проведения микробиологического процесса или процесса культивирования изолированных клеток растений или животных необходимо подготовить и посевной материал - предварительно выращенное малое по сравнению с основной стадией количество биологического агента.
Подготовка биокатализатора. Для процессов биотрансформации или биокатализа необходимо предварительно подготовить биокатализатор - либо фермент в свободном или закрепленном на носителе виде, либо биомассу микроорганизмов, выращенную предварительно до состояния, в котором проявляется ее ферментативная активность
Предварительная обработка сырья. Если сырье поступает в производство в виде, непригодном для непосредственного использования в биотехнологическом процессе, то проводят операцию по предварительной подготовке сырья. Например, при получении спирта пшеницу сначала дробят, а затем подвергают ферментативному процессу "осахаривания", после чего осахаренное сусло на биотехнологической стадии путем ферментации превращается в спирт.
Очистка продукта
Задача этой стадии - убрать примеси, сделать продукт максимально чистым.
Хроматография - процесс, напоминающий адсорбцию.
Диализ - процесс, в котором через полупроницаемую перегородку могут проходить низкомолекулярные вещества, а высокомолекулярные остаются.
Кристаллизация. Этот процесс базируется на различной растворимости веществ при разных температурах.
Концентрирование продукта
Дальнейшая задача - обеспечить его концентрирование.
На стадии концентрирования применяют такие процессы, как выпаривание, сушка, осаждение, кристаллизация с фильтрацией получившихся кристаллов, ультрафильтрация и гиперфильтрация или нанофильтрация, обеспечивающие как бы "отжим" растворителя из раствора.
Очистка стоков и выбросов
Очистка этих стоков и выбросов - специальная задача, которая обязательно должна решаться в наше экологически неблагополучное время. По существу очистка стоков - это отдельное биотехнологическое производство, имеющее свои подготовительные стадии, биотехнологическую стадию, стадию отстаивания биомассы активного ила и стадию дополнительной очистки стоков и переработки осадка.
Виды биологических объектов применяемых в биотехнологии, их классификация и характеристика. Биологические объекты животного происхождения. Биологические объекты растительного происхождения.
К объектам биотехнологии относятся: организованные внеклеточные частицы (вирусы), клетки бактерий, грибов, простейшие организмы, ткани грибов, растений, животных и человека, ферменты и ферментные компоненты, биогенные молекулы нуклеиновой кислоты, лектины, цитокинины, первичные и вторичные метаболиты.
В настоящее время большинство биообъектов биотехнологии представляется представителями 3-х надцарств:
1) Acoryotac – акориоты или безъядерные;
2) Procaryotac – прокариоты или предъядерные;
3) Eucaryotac – эукариоты или ядерные.
Представляются 5-ю царствами: к акариотам относят вирусы (неклеточная организованная частица); к прокариотам относят бактерии (морфологическая элементарная единица); к эукариотам относят грибы, растения и животные. Тип кодирование генетической информации ДНК (для вирусов ДНК или РНК).
Бактрии имеют клеточную организацию, но при этом материал ядра не отделен от цитоплазмы ни какими мембранами и не связан ни с какими белками. В основном бактерии одноклеточные их размер не превышает 10 микрометров. Все бактерии делятся на архиобактерии и эубактерии.
Грибы (Mycota) являются важными биотехнологическими объектами и продуцентами ряда важнейших соединений пищевых продуктов и добавок: антибиотики, растительные гормоны, красители, грибной белок, сыры различных типов. Микромицеты неформируют плодового тела, а макромицеты формируют. Имеют признаки животных и растений.
Растения (Plantae). Известно около 300 тысяч видов растений. Это дифференцированные органические растения, составные части которых ткани (мериместентные, покровные, проводимые, механические, основные и секреторные). К делению способны только мириместентные ткани. Любой вид растения при определенных условиях может давать неорганизованную клеточную массу делящихся клеток – каллус. Важнейшими биообъектами являются протопласты растительных клеток. Они лишены клеточной стенки. Используются в клеточной инженерии. Часто используют водоросли. Из них получают агар-агар и альгинаты (полисахариды, используемые для приготовления микробиологических сред).
Животные (Animalia). В биотехнологии широко применяются такие биообъекты как клетки различных животных. Кроме клеток высших животных используются клетки простейших животных. Клетки высших животных используются для получения рекомбинантной ДНК и для проведения токсикологических исследований.
Кафедра микробиологии и биохимии
Методические указания
К выполнению контрольной работы
по теме: «Применение методов генной инженерии в биотехнологии»
По дисциплине: Введение в биотехнологию
для направления 020200.62 «Биология
Форма обучения: очная
Мурманск
Составитель – Елена Викторовна Макаревич, канд. биолог. наук, профессор кафедры микробиологии и биохимии Мурманского государственного технического университета
Методические указания к выполнению контрольных работ рассмотрены и одобрены на заседании кафедры-разработчика «____»_________________2013 г., протокол № _____.
Рецензент – Ольга Юрьевна Богданова, канд. биол. наук, профессор кафедры микробиологии и биохимии Мурманского государственного технического университета
1. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ.. 4
2. Методические указания к выполнению контрольной работы 5
3. Вопросы для самопроверки... 6
6. ТАБЛИЦА ВАРИАНТОВ КОНТРОЛЬНЫХ РАБОТ…………………….………..22
1. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ
Контрольная работа представляет собой одну из форм текущего контроля знаний студентов, и его выполнение является обязательным для всех студентов. Если работа не зачтена, студент должен иметь возможность ее исправить, путем повторного выполнения контрольной работы. Студенты, не выполнившие контрольную работу, к экзамену не допускаются.
Целью выполнения контрольной работы является углубление и закрепление знаний студентов, полученных при теоретическом изучении дисциплины и позволяет студенту продемонстрировать знания и навыки, приобретенные за время обучения по теории, а также возможность их применения в практической деятельности.
Студенты выполняют контрольную работу в сроки, установленные графиком. Выполнение контрольной работы является завершающим этапом в изучении отдельных тем дисциплины «Введение в биотехнологию».
Методические указания к выполнению контрольной работы
на тему « Применение методов генной инженерии в биотехнологии» .
Для выполнения контрольной работы необходимо:
1. Изучить теоретические данные по курсу;
3. Ответить на вопросы по данной теме;
4. Решить предоставленные в методическом пособии тестовые задания;
Генетические основы совершенствования биообъектов.
Пути и методы, используемые при получении более продуктивных биообъектов и биообъектов с другими качествами, повышающими возможность их использования в промышленном производстве (устойчивость к инфекциям, рост на менее дефицитных средах, большее соответствий требованиям промышленной гигиены и т.д.).
Традиционные методы селекции. Вариационные ряды. отбор спонтанных мутаций. Мутагенез и селекция. Физические и химические мутагены и механизм их действия. Классификация мутаций. Проблемы генетической стабильности мутантов по признаку образования целевого биотехнологического продукта.
Клеточная инженерия и использование ее методов в создании микроорганизмов и клеток растений - новых продуцентов биологически активных (лекарственных) веществ. Протопластирование и слияние (фузия) протопластов микроорганизмов. Возможность межвидового и межродового слияния. Гибриды, получаемые после слияния протопластов и регенерации клеток. Слияние протопластов и получение новых гибридных молекул в качестве целевых продуктов. Протопластирование и активация "молчащих" генов. Возможности получения новых биологически активных веществ за счет активации "молчащих генов". Методы клеточной инженерии применительно к животным клеткам. Гибридомы. Значение гибридом для производства современных диагностических препаратов.
Генетическая инженерия и создание с помощью ее методов продуцентов новых лекарственных веществ. Основные принципы технологии рекомбинантной ДНК. Внехромосомные генетические элементы - плазмиды и их функции у микроорганизмов, используемых в биотехнологических процессах. Основные физико-химические характеристики плазмид. Взаимодействие плазмид с геномом хозяина. Роль плазмидной и фаговой ДНК в генетическом конструировании продуцентов биологически активных веществ. Транспозоны и их использование в конструировании продуцентов. Направленный мутагенез (ин витро) и его значение при конструировании продуцентов.
Понятие вектора в генетической инженерии. Векторные молекулы на основе плазмидной и фаговой ДНК. Химический синтез фрагментов ДНК. Методы секвенирования (определения последовательности нуклеотидов). Химический синтез гена.
Ферменты, используемые в генетической инженерии. Рестриктазы. Классификация и специфичность. Формирование "липких концов». Рестриктаза E.coli R1 и распознаваемая ею последовательность нуклеотидов. Лигазы и механизм их действия.
Последовательность операций при включении чужеродного гена в векторную молекулу. Перенос вектора с чужеродным геном в микробную клетку.
Генетические маркеры. Методы идентификации и изоляции клонов с рекомбинантной ДНК.
Проблемы экспрессии чужеродных генов в микроорганизмах. Гены животной клетки; экзоны, нитроны. Обеспечение возможности экспрессии генов млекопитающих в микробной клетке. Обратная транскриптаза.
Способы преодоления барьеров на пути экспрессии чужеродных генов. Стабилизация чужеродных белков (целевых продуктов) в клетке. Генетические методы, обеспечивающие выделение чужеродных белков в среду.
Микроорганизмы различных систематических групп: дрожжи, эубактерии, актиномицеты и др. как хозяева при экспрессии чужеродных генов. Специфические проблемы генетической инженерии при создании новых продуцентов белковых веществ, первичных метаболитов как целевых биотехнологических продуктов.
ВОПРОСЫ ДЛЯ САМОПРОВЕРКИ
- Перечислите традиционные методы селекции.
- Расскажите об использовании методов клеточной инженерии в создании микроорганизмов и клеток растений.
- Каковы механизмы действия физических и химических мутагенов?
- Назовите возможности получения новых биологически активных веществ за счет активации "молчащих генов".
- Раскройте понятие гибридонов.
- Перечислите методы идентификации и изоляции клонов с рекомбинантной ДНК.
- В различие между экзонами и интронами?
- Что такое экспрессия чужеродных генов?
ТЕСТОВЫЕ ЗАДАНИЯ
Выпишите правильный ответ:
1. Под термином «обратная генетика» понимают следующие манипуляции
1. ДНК - РНК - белок - модификация белка - клетка
2. белок - РНК - ДНК - модификация ДНК - клетка
3. РНК - модификация РНК - ДНК - белок
4. клетка - ДНК - РНК - белок - модификация белка
2. Трансгенные организмы получают путем ввода чужеродного гена в
1. соматическую клетку
2. яйцеклетку
3. сперматозоид
4. митохондрии
3. Акромегалия характерна для животных, содержащих чужеродный ген
1. инсулина
2. интерферона
3. соматостатина
4. соматотропина
4. Год, когда впервые показана роль нуклеиновых кислот в передаче наследственной
информации
1. 1940
2. 1944
3. 1953
4. 1957
5. Год, когда была создана модель двойной спирали ДНК
1. 1940
2. 1944
3. 1953
4. 1957
6. Первым объектом генной инженерии стала
1. E.coli
2. S.cerevisae
3. B.subtilis
7. Первыми объектами генной инженерии стали вирусы и плазмиды
1. S.cerevisae
2. B.subtilis
3. E.coli
8. В качестве вектора для введения чужого гена в животную клетку используют
1. плазмиды агробактерий
2. плазмиды бактерий
4. вироиды
5. вирус SV-40
9. В качестве вектора для введения чужого гена в животную клетку используют
1. ретровирусы
2. плазмиды бактерий
3. ДНК хлоропластов и митохондрий
4. вироиды
10. В качестве вектора для введения чужого гена в животную клетку не используют
1. вирус SV-40
2. ретровирусы
3. ДНК митохондрий
4. транспозоны
5. вироиды
11. В качестве вектора для введения гена в растительную клетку используют
1. вирус SV-40
2. вирус саркомы Рауса
3. плазмиды
4. вироиды
12. В качестве вектора для введения гена в растительную клетку используют
1. вирус SV-40
2. вирус саркомы Рауса
3. плазмиды агробактерий
13. В качестве вектора для введения гена в растительную клетку не используют
1. транспозоны
2. ДНК хлоропластов
3. плазмиды бактерий
4. вироиды
14. В состав вектора на основе вируса не входят последовательности, отвечающие за
1. вирулентность
2. способность к репликации
3. маркерный признак
4. патогенность
15. В состав вектора на основе вируса входят последовательности, отвечающие за
1. способность к передаче в клетку хозяина
2. способность к амплификации
3. маркерный признак
4. все перечисленные последовательности
16. Вектор должен быть
1. большим
2. небольшим
3. верны оба утверждения
17. В основе использования ДНК митохондрий и хлоропластов в качестве вектора лежит
1. кольцеобразная форма
2. объем
3. наличие гомологичных участков с ядерным геномом
4. верны все утверждения
18. Количество нуклеотидов, составляющих вироиды
1. 200 - 250
2. 270 - 300
3. 320 - 370
4. около 1000
19. Вироиды имеют форму
1. прямолинейную
2. кольцевую
3. спиралевидную
20. Транспозоны имеют форму
1. прямолинейную
2. кольцевую
21. Транспозоны впервые были открыты в
1. 30 - х годах
2. конце 40 -х годов
3. 1971 году
22. Транспозоны открыл
1. Поль Берг
2. Барбара Мак-Клинток
3. Фредерик Сэнгер
23. Год открытия вироидов
1. 1968
2. 1971
3. 1973
4. 1977
24. Вироидам представляют собой
1. 1 цепочечную ДНК
2. 1 цепочечную РНК
3. 2 цепочечную ДНК
4. 2 цепочечную РНК
25. Нуклеиновая кислота вироидов с белком
1. связана
2. не связана
26. Транспозоны играют важную роль в эволюции вилов
1. да
2. нет
30. При рестриктазно-лигазном методе происходит сшивание концов ДНК
1. тупой-липкий
2. липкий-липкий
3. тупой-тупой
31. При коннекторном методе происходит сшивание концов ДНК
1. тупой-липкий
2. липкий-липкий
3. тупой-тупой
32. Применение линкеров имеет смысл в том стучае, если при разрушении 2 типов ДНК рестриктазами образуются концы
1. одноименные липкие
2. разноименные липкие
3. тупые
33. Применение линкеров имеет смысл в том стучае, если при разрушении 2 типов ДНК рестриктазами образуются концы
1. одноименные липкие
2. тупой и липкий
3. тупые
34. Линкеры не применяют, если при разрушении 2 типов ДНК рестриктазами образуются концы
1. одноименные липкие
2. разноименные липкие
3. тупые
4. тупой и липкий
35. Фермент концевая трансфераза применяется при сшивании концов
1. одноименных липких
2. разноименных липких
3. тупых
4. тупого и липкого
36. Для сшивания тупых концов ДНК применяют лигазу в концентрациях
1. недостаточных
2. стандартных
3. избыточных
37. Для денатурации ДНК требуется
1. щелочной рН
2. кислый рН
3. кислый рН и высокая температура
4. щелочной рН и высокая температура
38. Температура денатурации ДНК (оС)
1. 37
2. 65
3. 100
39. Температура ренатурации ДНК (оС)
1. 37
2. 65
3. 100
40. При гибридизации спариваются фрагменты ДНК
1. одноцепочечные
2. двуцепочечные
3. одно- и двуцепочечные
41. При гибридизации возможно спаривание
1. ДНК - ДНК
2. ДНК - РНК
3. РНК - РНК
4. все перечисленные сочетания
42. Гибридизацию исследуемой нуклеиновой кислоты с ДНК-зондом проводят
1. в растворе
2. в геле
3. на нитроцеллюлозе
43. Чужеродная ДНК, попавшая в клетки в природе, как правило, не проявляет активности, так как разрушается ферментом
1. лигазой
2. метилазой
3. рестриктазой
4. транскриптазой
44. Год рождения генной инженерии
1. 1971
2. 1972
3. 1973
4. 1974
45. Первая гибридная ДНК содержала фрагменты ДНК
1. вируса и бактерии
2. 2-х вирусов и бактерии
3. бактерии, дрожжевой клетки и вируса
4. бактерии, вируса и животной клетки
46. Первая выделенная из бактериальной клетки эндонуклеаза расщепляла молекулы ДНК
1. в месте узнавания
2. на определнном расстоянии от места узнавания
3. в произвольном месте от места узнавания
47. Первую рестриктазу, которая расщепляла строго определенную последовательность ДНК выделили
1. Мезельсон и Юань
2. Мезельсон и Вейгл
3. Смит и Вилькокс
48. В состав полимеразы входит функциональных доменов
1. 1
2. 2
3. 3
4. 4
49. Фрагмент Кленова включает в себя
1. 5’-3’ полимеразу и 3’-5’ экзонуклеазу
2. 5’-3’ полимеразу и 3’-5’ полимеразу
3. 5’-3’ полимеразу и 5’-3’ экзонуклеазу
4. 3’-5’ экзонуклеазу и 5’-3’ экзонуклеазу
50. Диэфирную связь в неспаренных участках ДНК убирает
1. 5’-3’ полимераза
2. 3’-5’ экзонуклеаза
3. 5’-3’ экзонуклеаза
4. 3’-5’ полимераза
51. Диэфирную связь в двойных участках ДНК убирает
1. 5’-3’ полимераза
2. 3’-5’ экзонуклеаза
3. 5’-3’ экзонуклеаза
4. 3’-5’ полимераза
52. За удаление присоединенных во время репликации нуклеотидов отвечает
1. 5’-3’ полимераза
2. 3’-5’ экзонуклеаза
3. 5’-3’ экзонуклеаза
4. 3’-5’ полимераза
53. В процессах репарации ДНК, вырезая олигонуклеотиды дляной 10 н.п., участвует
1. 5’-3’ полимераза
2. 3’-5’ экзонуклеаза
3. 5’-3’ экзонуклеаза
4. 3’-5’ полимераза
54. Терминальная трансфераза катализирует присоединение нуклеотидов к концу
молекулы ДНК
1. 5’ - ОН
2. 3’ – ОН
55. Узнают и расщепляют молекулы ДНК в произвольных точках нуклеазы
1. 1 класса
2. 2 класса
3. 3 класса
4. 1 и 3 класса
5. 2 и 3 класса
56. Узнают и расщепляют молекулы ДНК строко в сайте узнавания или на фиксированном расстоянии от него нуклеазы
1. 1 класса
2. 2 класса
3. 3 класса
4. 1 и 3 класса
5. 2 и 3 класса
57. За рестриктазную и метилирующую активность отвечает 1 белок у эндонуклеаз рестрикции
1. 1 и 3 класса
2. 2 и 3 класса
3. 1 и 2 класса
4. 2 класса
5. 3 класса
58. За рестриктазную и метилирующую активность отвечают разные белки у эндонуклеаз рестрикции
1. 1 и 3 класса
2. 2 и 3 класса
3. 1 и 2 класса
4. 2 класса
5. 3 класса
59. Ложными изошизомерами являются
1. Hpa I и Eco RI
2. Hind III и Eco RI
3. Hpa I и Hind III
60. При разгоне ДНК в агарозном геле ближе к стартовой линии окажутся фрагменты
1. короткие
2. длинные
3. короткие
62. Для построения рестрикционной карты необходимо фрагменты ДНК последовательно обработать
1. 1 рестриктазой, затем 2 рестриктазой
2. 1 рестриктазой и смесью 1 и 2 рестриктаз
3. 1 рестриктазой, 2 рестриктазой и их смесью
63. Первая рестрикционная карта была получена для
1. бактериофага
2. плазмиды pBR 322
3. вируса саркомы Рауса
4. вируса SV-40
64. Рестрикционные карты позволяют определить
1. полную нуклеотидную последовательность
2. степень гомологии участков ДНК
3. нарушения в работе гена
4. структуру гена
65. Химический сиквенс ДНК основан на
1. синтезе комплементарного участка ДНК
2. разрушении 1 нуклеотида
3. разрушении одного из 4 нуклеотидов в каждой реакционной смеси
66. Химический сиквенс ДНК предложили
1. Сэнгер и Гилберт
2. Сэвидж и Максам
3. Максам и Гилберт
67. Ферментативный сиквенс ДНК предложил
1. Максам
2. Гилберт
3. Сэнгер
4. Сэвидж
68. При химическом сиквенсе ДНК метится
1. с одного конца
2. с обоих концов
3. по всей длине
69. Модификация нуклеотидов при ферментативном сиквенсе предполагает изменение концов
1. 3’-ОН
2. 5’-ОН
3. 3’-ОН и 5’-ОН
70. При ферментативном сиквенсе модифицированные нуклеотиды добавляют по сравнению с нормальными в
1. избытке
2. равном соотношении
3. недостатке
71. Для недорестрикции эндонуклеазы добавляют
1. в недостатке
2. избытке
72. Недорестрикция обычно применяется при использовании рестриктаз
1. крупнощепящих
2. мелкощепящих
3. 1 класса
4. 3 класса
73. Для необратимого связывания ДНК с нитроцеллюлозой необходима температура (оС)
1. 65
2. 70
3. 80
4. 100
74. Для необратимого связывания ДНК с нитроцеллюлозой необходимы высокая температура и
1. обычное давление
2. высокое давление
3. низкое давление
4. вакуум
75. Перенос ДНК на нитроцеллюлозный фильтр называется
1. Северный блоттинг
2. Южный блоттинг
3. Западный блоттинг
76. Перенос РНК на нитроцеллюлозный фильтр называется
1. Северный блоттинг
2. Южный блоттинг
3. Западный блоттинг
77. Перенос белка на нитроцеллюлозный фильтр называется
1. Северный блоттинг
2. Южный блоттинг
3. Западный блоттинг
78. Фильтровальная бумага при блоттинге обеспечивает ток буферного раствора в направлении
1. электрофореза
2. обратном электрофорезу
3. перпендикулярном электрофорезу
79. Название «метод дробовика» применяется по отношению к библиотекам
1. геномным
2. клоновой ДНК
80. С синтеза ДНК на матрице РНК начинается создание библиотек
1. геномных
2. клоновой ДНК
81. При создании геномной библиотеки геном представлен
1. целиком
2. фрагментарно
82. Создание геномной библиотеки можно считать амплификацией ДНК
1. in vitro
2. in vivo
83. Создание клоновой библиотеки можно считать амплификацией ДНК
1. in vitro
2. in vivo
84. Полимеразную цепную реакцию можно считать амплификацией ДНК
1. in vitro
2. in vivo
85. При получении животных белков с помощью бактериальной клетки лучше использовать библиотеку ДНК
1. клоновую
2. геномную
86. Метод бесклеточного молекулярного клонирования был разработан в
1. 1973 году
2. 1976 году
3. 1977 году
4. 1985 году
87. Полимеразную цепную реакцию разработал
1. Берг
2. Гилберт
3. Саузерн
4. Маллис
88. Методику переноса ДНК на нитроцеллюлозный фильтр разработал
1. Берг
2. Гилберт
3. Саузерн
4. Маллис
89. При полимеразной цепной реакции количество ДНК от цикла к циклу увеличивается
1. на несколько фрагментов
2. в арифметической прогрессии
3. в геометрической прогрессии
90. Цикл амплификации ДНК in vitro занимает (в минутах)
1. 5
2. 10
3. 15
4. 20
91. Для целей медицинской диагностики чаще всего используют амплификацию ДНК с помощью клонирования
1. в вирусе
2. в плазмиде
3. бесклеточного молекулярного
92. Промотор b-лактамазы
1. сильный регулируемый
2. слабый нерегулируемый
3. слабый регулируемый
4. сильный нерегулируемый
93. Промотор, полученный из бактериофага l
1. сильный регулируемый
2. слабый нерегулируемый
3. слабый регулируемый
4. сильный нерегулируемый
94. Промотор, полученный из бактериофага l регулируется
1. триптофановым голоданием
2. лактозой
3. температурой
95. Наличие интронов и экзонов не характерно для ДНК
1. дрожжей
2. растений
3. животных
4. бактерий
96. Только для эукариотической клетки характерно наличие
1. аттенуатора
2. последовательности Шайна-Дальнарно
3. модулятора
97. Только для эукариотической клетки характерно наличие
1. аттенуатора
2. промотора
3. усилителя
98. При трансфекции лигирование маркерного признака с вводимым геном
1. обязательно
2. необязательно
99. Эффективность вхождения ДНК в клетки
1. высока
2. невысока
100. Частота трансформации ДНК клетки при трансфекции
1. высока
2. невысока
101. Стабильную трансформацию претерпевает при трансфекции 1 из
1. 10 клеток
2. 100 клеток
3. 1000 клеток
102. Метод микроинъекций был разработан
1. Максамом и Гилбертом
2. Мезельсоном и Юанем
3. Андерсеном и Диакумакосом
103. Стабильная трансформация клеток выше при
1. трансфекции
2. микроинъекции
3. достаточно высока в обоих случаях
104. При микроинъекциях трансформируется клеток (%)
1. 1
2. 10
3. 30
4. 50
5. 100
105. Реплицирует рибосомные гены промотор
1. Pol I
2. Pol II
3. Pol III
106. Реплицирует структурные гены белков промотор
1. Pol I
2. Pol II
3. Pol III
107. Реплицирует гены, кодирующие небольшие РНК промотор
1. Pol I
2. Pol II
3. Pol III
108. Для экспрессии эукариотических генов в клетке прокариот необходимо ставить их под контроль регуляторных элементов
1. эукариот
2. прокариот
3. прокариот и эукариот
109. Аттенуаторы располагаются между
1. 1 и 2 структурным геном
2. в конце структурного гена
3. между промотором и 1-м структурным геном
4. между промотором и 2-м структурным геном
110. В качестве маркера для бактериальных клеток используют ген фермента
1. тимидинкиназы
2. лактозы
3. антибиотика
111. В качестве маркера для животной клетки используют ген
1. тимидинкиназы
2. лактозы
3. антибиотика
112. При коннектором методе с использование концевой трансферазы бессмысленные последовательности образовываться
1. могут
2. не могут
113. Метод, наиболее часто используемый при построении гибридных ДНК
1. рестриктазно-лигазный
2. коннекторный
3. с применение линкеров
114. При рестриктазно-лигазном методе бессмысленные последовательности образовываться
1. могут
2. не могут
115. Номенклатуру рестриктаз предложили
1. Смит и Натанс
2. Мезельсон и Юань
3. Смит и Вилькокс
116. Сайты узнавания рестриктазами относительно поворота на 180оС
1. симметричны
2. не симметричны
Закончить предложение:
117. На изменении проницаемости мембраны при пропускании высоковольных импульсов основан метод _____________.
118. Обрабатывая ультразвуком водные эмульсии фосфолипидов, получают _______.
119. На образовании пор в цитоплазматической мембране основан метод _________
120. Для защиты экзогенного генетического материала при введении его в клетку применяют __________
121. ДНК спермы лосося, добавленная к специфическому гену - _________
122. Введение ДНК с помощью преципитата кальция - ______________
123. Регуляторная последовательность, способная понизить уровень транскрипции даже при наличии сильного промотора ___________.
124. Двуцепочечный фрагмент ДНК, необходимый для начала работы полимеразы, называется ___________
125. Вектор, способный к репликации и в бактеральной, и животной клетке - _______
126. Последовательность из 6-8 нуклеотидов, отвечающая за связывание РНК с рибосомой - __________ _____________.
127. Регулируемый промотор называется ____________.
128. Последовательность ДНК, с которой начинается считывание информации - ________
129. Рестриктаза, выделенная из Streptomyces albus, называется _____
130. Рестриктаза, выделенная из Escherichia coli, называется _____
131. Рестриктаза, выделенная из Streptcoccus aureus, называется _____
132. Метилаза, выделенная из Streptomyces albus, называется _____
133. Метилаза, выделенная из Escherichia coli, называется _____
134. Метилаза, выделенная из Streptcoccus aureus, называется _____
135. Рестриктаза, выделенная из Haemophilus parahaemolyticus, называется _____
136. Ферментативный метод предполагает использование __________ ________
137. Фермент, отвечающий за миграцию определенных участков ДНК в пределах хромосомы - _______________.
138. В качестве вектора для введения генов в животную клетку используется ДНК-содержащий вирус ____________.
139. Генетические элементы клетки, способные к миграции в пределах хромосомы, называются _____________.
140. РНК-содержащие вирусы, способные менять геном клетки - __________.
141. Конструирование in vitro функциоонально активных генетических структур называется ________________ ____________.
142. Создание в пробирке рекомбинантных ДНК называется _______ ________.
143. Искусственные генетические структуры называются ______________.
144. Многократное удвоение плазмиды или фрагмента ДНК - ___________.
145. Удвоение гена в клетке или пробирке называется ____________.
146. Фермент, отвечающий за специфическое мечение ДНК в клетке - ________.
147. Фермент, отвечающий за восстановление фосфодиэфирной связи в молекуле ДНК - _____________.
148. Фермент, отвечающий за синтез комплементарной цепи ДНК - ____________.
149. Фермент, модифицирующий «тупые» концы ДНК - ______________.
150. Фермент, вносящий разрывы в двойную цепь ДНК - ____________.
151. За синтез ДНК на матрице РНК отвечает фермент __________ ____________.
152. Рестриктаза, выделенная из Bacillus subtilis, называется _____
153. Промотор, иниициирующий транскрипцию редко - ____________
154. Промотор, инициирующий транскрицию часто - _______________.
155. Небольшой олигонуклеотид, содержащий разноименные липкие концы называется ___________.
156. Белок, препятствующий связыванию полимеразы с ДНК - ____________
157. Этап полимеразной цепной реакции, когла образуются одноцепочечный фрагмент, связанный с праймером - _____________.
158. Введение ДНК в клетки с помощь. ДЭАЭ-декстрана - _______________.
159. Способ введения ДНК, основанныей на изменении проницаемости ЦПМ путем обработки электроимрульсами называется
| п\п | Название учебников, учебных пособий и других источников | Авторы (под ред.) | Издательство | Год издания | ||
| Основная: | ||||||
| 1. | Основы биотехнологии: учебное пособие | Т. А. Егорова, С. М. Клунова, Е. А. Живухина | М.: Академия | |||
| 2. | Современная биотехнология | Елдышев Ю.Н. | М:Тайдекс Ко | |||
| 3. | Гидромикробиологический анализ сточных вод. Методические указания. | Макаревич Е.В. Литвинова М.Ю. | Мурманск МГТУ | |||
| 4. | Экология микроорганизмов | Нетрусов А.И. | М.: Академия | |||
| Промышленная микробиология и биотехнология | Макаревич Е.В. | МГТУ | ||||
| Основы промышленной биотехнологии: учеб. пособие для вузов | Бирюков, В. В. | М. : Колос | ||||
| Молекулярная биотехнология: Принципы и применение / пер. с англ. Н. В. Баскаковой | Глик, Б. | М. : Мир | ||||
| Теоретические основы биотехнологии и практические аспекты их использования при производстве ряда биологически активных веществ из сырья животного, водного и растительного происхождения в народном хозяйстве России и медицине. Ч.1,2 | Семенов, Б. Н. | КГТУ. - Калининград | ||||
| Микроорганизмы заквасок кисломолочных продуктов. Методические указания. | Макаревич Е.В., Литвинова М.Ю. | Мурманск МГТУ | 2009. | |||
| Методические указания к лабораторным работам по дисциплине «Ведение в биотехнологию» | Литвинова М.Ю. | Мурманск МГТУ | ||||
| Дополнительная: | ||||||
| Введение в биотехнологию | Бекер М.Е. | М.: Пищевая пром | ||||
| Определитель бактерий Берджи. В 2 т. | Под ред. Дж. Хоулта, Н. Крига, П. Смита и др. | М.: Мир | ||||
| Промышленная микробиология. | Под ред. Егорова Н.С. | М.: Высшая школа | ||||
| Техническая микробиология рыбных продуктов. | Дутова Е.Н. и др. . | М.: Пищевая пром | ||||
| Микробиология пищевых производств. | Вербина Н.М., Каптерова Ю.В. | М.: Агропромиздат | ||||
| Основные питательные среды для культивирования микроорганизмов. Приготовление питательных сред. Методические указания к выполнению лабораторной работы. | Богданова О.Ю., Макаревич Е.В. | Мурманск МГТУ | ||||
| Микробиология продуктов животного происхождения | Мюнх Г.Д., Заупе Х., Шрайтер М.и др. | М.: Агропромиздат | ||||
| Микробиология в пищевой промышленности. | Жвирблянская А.Ю., Бакушинская О.А. | М.: Пищевая пром-сть | ||||
ТАБЛИЦА ВАРИАНТОВ ЗАДАНИЙ
| Предпос-ледняя цифра шифра | Последняя цифра шифра | |||||||||
| 1, 17, 29, 48, 134,80,127 | 2, 18, 31,49, 133,81,128 | 3, 19, 32,50, 132,82,129 | 4, 20, 33,51, 131,83,130 | 5, 21, 34,52, 130,84,131 | 6, 22, 35,53, 129,85,132 | 7, 23, 36,54, 128,86,133 | 8, 24, 37,55, 127,88,134 | 9, 25, 38,56, 126,89,135 | 10, 26, 30,57, 125,87,136 | |
| 11, 27, 40,52, 124,90 ,137 | 12, 28, 29,46, 123,91,138 | 13, 17, 31,45, 122,92,139 | 14, 18, 33,44, 121,93,140 | 15, 19, 40,43, 120,94,141 | 16, 20, 34,42, 119,95,142 | 1, 21, 39,41, 118,96,143 | 2, 22, 40,60, 117,97,144 | 3, 23, 30,59, 116,98,145 | 4, 24, 40,58, 115,99,146 | |
| 5, 25, 36,45, 114,70,147 | 6, 19, 26, 32, 113,71,148 | 7, 27, 29,51, 112,72,149 | 8, 28, 31,44, 111,73,150 | 9, 17, 37,58, 110,74,151 | 10, 18, 39,60, 109,75,152 | 11, 19, 34, 42, 108,76,153 | 12, 20, 30,50, 107,77,154 | 13, 21, 37,56, 106,78,155 | 14, 22, 38, 47, 105,79,156 | |
| 15, 23, 32,59, 135,43,157 | 16, 24, 38,49, 103,85,158 | 1, 25, 38,51, 102,72,159 | 2, 26, 58, 39, 101, 126,85 | 3, 27, 31,52, 100,94,127 | 4, 28, 37,44, 99,112,128 | 5, 17, 30, 56, 98,130,129 | 6, 18, 34, 55, 97,69,130 | 7, 19, 39,60, 96,123,131 | 8, 20, 33, 44, 95,110,132 | |
| 9, 21, 39,47, 94,127,133 | 10, 22, 40,51, 93,128,134 | 11, 23, 39, 47, 92,129,135 | 12, 25, 33, 44, 91,130,136 | 13, 26, 31,59, 90,131,137 | 14, 28, 30,58, 89,132,138 | 15, 27, 31,42, 88,133,139 | 16, 28, 36,45, 87,134,140 | 1, 17, 34, 56, 86,102,141 | 2, 18, 39,57, 85,103,142 | |
| 3, 19, 38,51, 84,104,143 | 4, 21, 38,53, 83,105,144 | 5, 20, 33,50, 82,106,145 | 6, 23, 29,57, 81,107,146 | 7, 22, 30,59, 80,108,147 | 8, 25, 29,60, 79,109,148 | 9, 24, 38,49, 78,110,149 | 10, 27, 31,54, 77,111,150 | 11, 25, 39,42, 76,112,151 | 12, 24, 34,52, 75,113,152 | |
| 13, 17, 32,41, 74,114,153 | 14, 18, 33,42, 73,115,154 | 15, 19, 40,59, 72,116,155 | 16, 20, 30,43, 71,117,156 | 1, 21, 30,44, 70,118,157 | 2, 22, 31,45, 69,119,158 | 3, 23, 29,46, 68,120,159 | 4, 24, 39,47, 67,121,127 | 5, 26, 31,60, 113,95,128 | 6, 27, 40,55, 66,122,129 | |
| 7, 28, 33,48, 65,123,130 | 8, 28, 32,49, 64,124,131 | 9, 17, 30,50, 73,125,132 | 10, 18, 38,51, 100,78,133 | 11, 19, 39,52, 101,77,134 | 12, 20, 32,52, 102,83,135 | 13, 21, 34,53, 103,84,136 | 14, 22, 29,54, 104,85,137 | 15, 28, 33,52, 105, 86,138 | 16, 23, 31,45, 106,87,139 | |
| 1, 27, 34, 55, 107,72,140 | 2, 26, 30,56, 108,74,141 | 3, 22, 40,57, 109,75,142 | 4, 25, 39,58, 110,76,143 | 5, 26, 40,59, 111,77,144 | 6, 17, 33,60, 112, 78,145 | 7, 18, 38,45, 113,79,146 | 8, 19, 35, 41, 114,90,147 | 9, 20,29,53, 115,134, | 10,21,38,56,116, 133,149 | |
| 11,22,30,42,150 117,132 | 12, 23, 37,43, 153 118,131 | 13, 24, 32,44,154 119,57 | 14, 27, 40,68,155 120,93 | 15, 23, 38,66,156 121,84 | 16, 23, 30,51,157 122, 74 | 1, 22, 40,78,158 123, 59 | 2, 17, 39,99,159 124,55 | 3, 18, 33,41,160 125,96 | 4, 19, 29,45,143 126,87 |
Похожая информация.
Методы совершенствования биообъектов методом мутогенеза. Характеристика мутогенов.
Изменение биообъекта, благоприятное для его использования в производстве, должно передаваться по наследству и, соответственно, вызываться мутацией. На биохимическом уровне мутация - изменение первичной структуры ДНК в конкретном ее участке, что, в конечном счете, приводит к изменению фенотипабиообъекта.
Долгое время понятие мутации относили только к хромосомам у прокариот и хромосомам (ядру) у эукариот. В настоящее время кроме хромосомных мутаций появилось также понятие мутаций цитоплазматических (плазмидных - у прокариот, митохондриальных и плазмидных - у эукариот).
Спонтанные мутации встречаются, как правило, довольно редко. Разброс по степени выраженности признаков обычно невелик.Совершенствование биообъектов путем предварительного мутагенеза и последующей селекции оказалось гораздо более действенным.
Мутагенез осуществляется при обработке биообъекта физическими или химическими мутагенами. В первом случае, как правило, это ультрафиолетовые, гамма-, рентгеновские лучи; во втором - нитрозометилмочевина, нитрозогуанидин, акридиновые красители, некоторые природныевещества (например, из ДНК-тропных антибиотиков вследствие их токсичности не применяемых в клинике инфекционных заболеваний).
Механизма активности как физических, так и химических мутагенов связан с их непосредственным действием на ДНК (прежде всего на азотистые основания ДНК, что выражается в сшивках, димеризации, алкилировании последних, интеркаляции между ними).
Подразумевается,естественно, что повреждения не приводят к летальному исходу. Последующей задачей является отбор и оценка именно нужных биотехнологу мутаций. Эта селекционная часть работы в целом весьма трудоемка.
В первую очередь биотехнолога интересуют мутантные культуры, обладающие повышенной способностью к образованию целевого продукта. Потенциальные возможности мутагенеза (с последующей селекцией)обусловлены зависимостью биосинтеза целевого продукта от многих метаболических процессов в организме продуцента. Весьма эффективный путь увеличения образования целевого продукта - нарушение системы ретроингибирования.
Повысить активность продуцента можно также, изменив (за счет мутаций) систему транспорта предшественников целевого продукта в клетку.
Наконец, иногда целевой продукт прирезком увеличении его образования отрицательно влияет на жизнеспособность собственного продуцента (так называемый суицидный эффект). Повышение резистентности продуцента к образуемому им же веществу часто необходимо для получения, например, суперпродуцентов антибиотиков.
Одним из самых блестящих примеров эффективности мутагенеза с последующей селекцией по признаку увеличения образования целевогопродукта является история создания современных суперпродуцентов пенициллина. Работа с исходными биообъектами - штаммами (штамм - клоновая культура, однородность которой по определенным признакам поддерживается отбором) гриба Penicilliumchrysogenum, выделенными из природных источников, велась с 1940-х гг. в течение нескольких десятилетий во многих лабораториях. Вначале некоторый успех былдостигнут при отборе мутантов, появившихся в результате спонтанных мутаций. Затем перешли к индуцированию мутаций физическими и химическими мутагенами. В результате ряда удачных мутаций и ступенчатого отбора все более продуктивных мутантов активность штаммов сейчас в 100 тыс. раз выше, чем у обнаруженного А.Флемингом исходного штамма, с которого и началась история открытия пенициллина.
Производственныештаммы крайне нестабильны вследствие того, что многочисленные искусственные изменения в геноме клеток штамма сами по себе для жизнеспособности этих клеток положительного значения не имеют. Поэтому мутантные штаммы требуют постоянного контроля при хранении:
Совершенствование биообъектов применительно к производству не исчерпывается только повышением...
План лекции
1. Понятие биообъекта.
2. Классификация биообъектов как продуцентов лекарственных и диагностических препаратов и их функции.
3. Макромолекулы природного происхождения – промышленные биокатализаторы.
4. Совершенствование биообъектов методами мутагенеза и селекции.
5. Мутации
а) понятие
б) мутагены
в) классификация
6. Вариационный ряд.
7. Методы отбора.
8. Мутасинтез.
9. Совершенствование биообъектов методами клеточной инженерии.
а) этапы работы
б) перспективы
Самым главным элементом биотехнологического производства, определяющим его специфику, является биообъект.
Биообъектом может быть целостный, сохранивший жизнеспособность, многоклеточный или одноклеточный организм. Им могут являться изолированные клетки многоклеточного организма, а также вирусы и выделенные из клеток мультиферментные комплексы, включенные в определенный метаболический процесс. Наконец, биообъектом может быть индивидуальный изолированный фермент.
Функция биообъекта – полный биосинтез целевого продукта, включающий обычно ряд этапов, то есть последовательных ферментативных реакций или, в крайнем случае, катализ лишь одной ферментативной реакции, которая имеет ключевое значение для получения целевого продукта.
Биообъект, осуществляющий полный биосинтез целевого продукта принято именовать продуцентом. Иммобилизированный биообъект, являющийся индивидуальным ферментом или выполняющий функцию одной ферментативной реакции используемой биотехнологом – именуют промышленным биокатализатором.
Таким образом, к биообъектам могут быть отнесены как макромолекулы, так микро- и макроорганизмы, то есть от вирусов до человека. В качестве макромолекул в промышленном производстве используются все известные классы ферментов, но наиболее часто - гидролазы и трансферазы.
Наиболее широко в качестве биообъектов используются микроорганизмы . Как биообъекты, микробные клетки прокариот и эукариот в современном биотехнологическом производстве являются продуцентами первичных метаболитов, используемых в качестве лекарственных средств: аминокислот, азотистых оснований, липидных структур, коферментов, моно- и дисахаров, ферментов медицинского назначения, применяемых в заместительной терапии и т.д.
Микроорганизмы образуют также огромное количество вторичных метаболитов, многие из которых также нашли применение в клинике. Например, гормоны, антибиотики, витамины и другие перспективные корректоры гомеостаза клеток млекопитающих.
Итак, что же мы подразумеваем под термином "совершенствование биообъекта"? - Прежде всего – это повышение продуктивности биообъекта. Далее, какие же изменения нужны при совершенствовании биообъекта? - только наследственные. Это изменения, локализованные в ДНК, передающиеся при репликации ДНК и, соответственно, при размножении биообъекта (наследственные изменения). Только это, собственно, и интересует биотехнологов. То есть, наследственные изменения фенотипа - это изменения, которые реализуются, при изменении ДНК.
По выраженности почти любого признака в микробной популяции составляют вариационный ряд. Большинство клеток имеют среднюю выраженность признака.
Итак, по каким же специфическим свойствам мы совершенствуем биообъект?
1. Продуктивность
2. Экономичность (микроорганизм использует более дешевую и питательную среду).
3. Дефицитность (микроорганизм использует более доступную питательную среду).
4. Вязкость (в случае жидкой культуральной среды).
Поскольку из цеха ферментации культуральная среда (жидкость) идет в цех выделения и очистки, то там сотрудники часто жалуются на высокую вязкость культуральной жидкости, в результате чего мицелий невозможно ни отцентрифугировать, ни отфильтровать. Значит, задача селекционеров - улучшение свойств культуральной жидкости.
5. Промышленная гигиена.
Например, когда нарабатывается антибиотик цефалоспорин, очень трудно находиться в помещении (запах тухлой капусты). Значит, в идеале штамм должен выделять как можно меньше летучих веществ.
6. Устойчивость к заболеваниям.
Вы знаете, что если у вас биообъект – растение, то он может быть поражен бактериями, грибами и т.д. А если у вас биообъектом является микробный гриб или актиномицет, то он может быть поражен фагами (т.е. микробными вирусами).
Если рассмотреть цели клеточной инженерии, то можно сказать, что в идеале с ее помощью мы можем получать межвидовые и межродовые гибриды микроорганизмов, а также – можем получать гибриды клеток между отдаленными в эволюционном отношении многоклеточными организмами. Новое направление в биотехнологии – сочетание клеточной инженерии с инженерной энзимологией непосредственно в производстве.
Лекция №3
Совершенствование продуцентов (биообъектов) методами генетической инженерии.
План лекции
1. Понятие генетической инженерии.
2. Схема этапов работы генного инженера.
3. Факторы, определяющие выбор микроорганизма-продуцента.
4. Понятие и функции плазмидного вектора.
5. Функции рестриктаз и лигаз.
6. Гены-маркеры.
7. Явление сплайсинга
Наибольшие практические успехи генетической инженерии применительно к биотехнологии лекарств достигнуты в настоящее время в области создания штаммов микроорганизмов-продуцентов видоспецифичных для человека белков. Такие белки для микробной клетки являются чуждыми, в организме же человека одни из них играют роль биорегуляторов (белковые гормоны), другие – факторов врожденного иммунитета (интерфероны) и т. д.
Технология рекомбинантных ДНК (её называют также молекулярным клонированием или генной инженерией) – это совокупность экспериментальных процедур, позволяющая осуществить перенос генетического материала из одного организма в другой. Никакого единого универсального набора методик здесь не существует, но чаще всего эксперименты проводятся по строго определенной схеме. Генетическая инженерии – это соединение фрагментов ДНК (природного происхождения, синтетических или тех и других) в пробирке, т. е. in vitro и последующее введение новых (рекомбинантных) структур в живую клетку с тем условием, чтобы введенный, точно охарактеризованный фрагмент ДНК реплицировался после включения в хромосому или автономно экспрессировался.
Схему этапов работы генного инженера.
1. Соединение фрагментов ДНК, т.е. нуклеотидных последовательностей в пробирке (могут быть и синтетические последовательности или смесь природных и синтетических последовательностей).
2. Далее, к гену, кодирующему целевой белок присоединяется нуклеотидная последовательность, кодирующая так называемую лидерную последовательность аминокислот (преимущественно гидрофобных). Синтезированный в клетке целевой продукт с такой лидерной последовательностью аминокислот проходит с их помощью через липидные слои цитоплазматической мембраны из клетки наружу.
3. Затем, производится включение гена в клетку, но «не прямо в клетку, конечно» так как, вы понимаете, что клетка окружена оболочкой и для включения в неё генов приходится использовать так называемые «транспортные устройства» на основе плазмид.
При выборе микроорганизма учитывается ряд обстоятельств.
1. Поскольку микроорганизм будет выращиваться в производственных условиях в большом количестве и с ним будут контактировать многие работники предприятия (биологи, химики и т.д.), поэтому желательно, чтобы он не был патогенным. Также необходимо, чтобы в целевом генно-инженерном продукте не было присутствия даже следов микробных токсинов.
2. Как чужеродная для клетки структура, проникший в клетку вектор не должен расщепляться нуклеазами клетки. Генетический материал должен сохраняться.
3. У будущего продуцента целевого продукта необходимо ослабить те системы репарации на уровне ДНК, которые могут уничтожить вектор. То есть рибосомы потенциального продуцента должны воспринимать информационную РНК, соответствующую чужеродному материалу.
4. Образовавшийся чужеродный для клетки белок (для биотехнолога - целевой продукт) не должен расщепляться ее протеазами, т.е. он не должен подвергаться воздействию систем, гидролизующих чужеродные белки.
5. Наконец, желательно, чтобы у потенциального продуцента чужеродного белка, последний выводился из клетки в среду. Этим облегчается его последующее выделение и очистка.
Таким образом, нужно иметь ген, подходящую клетку и транспортное устройство, которое получило название вектор. Вектор конструируется на основе плазмид. Плазмида состоит из 2-х спиральной ДНК (замкнутая кольцевая молекула), в принципе тоже самое, как и у бактериальной хромосомы. Отличие заключается в том, что плазмида раз в 100 меньше хромосомы. Например, если в бактериальной хромосоме содержится примерно 3000 генов (от 1 тысячи до 6-7 тысяч), то в плазмиде - примерно 30 генов.
Так вот, надо. Что используется для этого? Для того чтобы ввести ген в вектор используются ферменты рестриктазы (от слова restrict - разрезание), которые по биохимической классификации относятся к нуклеазам (к эндонуклеазам). Затем, чтобы ген закрепить прочно в векторе (транспортном устройстве) вступают в действие другие ферменты - это лигазы (от слова "лигатура" - сшивание), которые "сшивают" ген и вектор ковалентной связью.
Сплайсинг (от англ. splice - сращивать или склеивать концы чего-либо) - процесс вырезания определенных нуклеотидных последовательностей из молекул РНК и соединения последовательностей, сохраняющихся в «зрелой» молекуле, в ходе процессинга РНК. Наиболее часто этот процесс встречается при созревании информационной РНК (иРНК) у эукариот.
Лекция №4
Геномика и протеомика
План лекции
1. Периоды развития генетики.
2. Секвенирование генома.
3. Цель и классификация геномики.
4. Модельные микроорганизмы.
5. Существенность гена.
6. Философские проблемы геномики.
7. «house kеeping genes» и «ivi genes».
8. Система «IVET».
9. Протеомика.
Что собственно значит геномика? Чем она отличается от генетики? Геномика во главу угла ставит уже не ген, а полный геном микробной, растительной и животной клеток. Геном - это уже качественный скачок вперед, демонстрирующий преодоление массы трудностей как технических и теоретических. Итак, геном прокариот, как вы знаете, в наследственном, т.е. генетически рассматриваемом отношении - это одна хромосома, т.е. кольцевая, замкнутая ДНК. Что касается генома эукариот (помните, там оформленное ядро, мембрана), то он, как правило, сложнее, так как клетки эукариот имеют несколько хромосом. У прокариот геном - гораздо проще, чем у эукариот, количество генов у них гораздо меньше, чем у эукариот. И мы с вами будем рассматривать некоторые примеры, используя клетки именно прокариот, геном которых является более простым.
Теперь, геномика расматривающая ген целиком, возможна только тогда, когда осуществлено секвенирование этого гена. От (англ.) секвенс- последовательность. В данном случае «секвенс» - последовательность нуклеотидных пар ДНК. Цель геномики - установление полной генетической характеристики всей клетки: установление количества содержащихся в ней генов и их последовательности, установление количества нуклеотидов в каждом гене и их последовательности, установление функций каждого гена применительно к метаболизму организма.
Несмотря на то, что геномика как наука, возникла относительно недавно, условно можно выделить определенные направления. Ну сама по себе геномика - это структурная оценка генома в целом: вы определяете путем секвенирования последовательность пар нуклеотидов, то есть сначала структуру отдельного гена, а затем и структуру всего генома.
Однако по ряду отдельных вопросов вы ведете исследования в направлении, так называемой сравнительной геномики . Значит, секвенируете геномы и гены в разных организмах и сопоставляете их друг с другом и решаете определенные теоретические и практические вопросы.
Еще одно очень важное направление, оказавшееся в дальнейшем ещё и очень трудоемким - это геномика функциональная или метаболическая . Идентификация генов проводится с помощью специальных компьютерных программ, в которых описаны геномы так называемых модельных микроорганизмов.
Теперь следующий очень важный момент - у каждого гена есть стартовая часть, есть детерминирующая часть и есть рамка считывания, т.е. структурный ген, которой индивидуален для каждого гена. А вот стартовая и детерминирующая части, как правило, стандартны (за редким исключением).
Итак, важнейшая проблема заключается в том, - каким образом от шифра перейти к функции.
Биообъект -это продуцент, биосинтезирующий нужный продукт, либо катализатор, фермент, который катализирует присущую ему реакцию.
Требования, предъявляемые к биологическим объектам
Для реализации биотехнологических процессов важными параметрами биообъектов являются: чистота, скорость размножения клеток и репродукции вирусных частиц, активность и стабильность биомолекул или биосистем.
Следует иметь в виду, что при создании благоприятных условий для избранного биообъекта биотехнологии эти же условия могут оказаться благоприятными, например, и для микробов - контаминантов, или загрязнителей. Представителями контаминирующей микрофлоры являются вирусы, бактерии и грибы, находящиеся в культурах растительных или животных клеток. В этих случаях микробы-контаминанты выступают вредителями производств в биотехнологии. При использовании ферментов в качестве биокатализаторов возникает необходимость предохранения их в изолированном или иммобилизованном состоянии от деструкции банальной сапрофитной (не болезнетворной) микрофлорой, которая может проникнуть в сферу биотехнологического процесса извне вследствие нестерильности системы.
Активность и стабильность в активном состоянии биообъектов - одни из важнейших показателей их пригодности для длительного использования в биотехнологии.
Таким образом, независимо от систематического положения биообъекта, на практике используют либо природные организованные частицы (фаги, вирусы) и клетки с естественной генетической информацией, либо клетки с искусственно заданной генетической информацией, то есть в любом случае используют клетки, будь то микроорганизм, растение, животное или человек. Для примера можно назвать процесс получения вируса полиомиелита на культуре клеток почек обезьян в целях создания вакцины против этого опасного заболевания. Хотя мы заинтересованы здесь в накоплении вируса, репродукция его протекает в клетках животного организма. Другой пример с ферментами, которые будут использованы в иммобилизованном состоянии. Источником ферментов также являются изолированные клетки или специализированные ассоциации их в виде тканей, из которых изолируют нужные биокатализаторы.
Классификация биообъектов
1) Макромолекулы
Ферменты всех классов (чаще гидролазы и трансферазы); в т.ч. в иммобилизированном виде (связанные с носителем) обеспечивающем многократность использования и стандартность повторяющихся производственных циклов;
ДНК и РНК - в изолированном виде, в составе чужеродных клеток.
2) Микроорганизмы
Вирусы (с ослабленной патогенностью используются для получения вакцин);
Клетки прокариоты и эукариоты - продуценты первичных метаболитов: аминокислот, азотистых оснований, коферментов, моно- и дисахаров, ферментов для заместительной терапии и т.д.); -продуценты вторичных метаболитов:антибиотики, алкалоиды, стероидные гормоны, и др.;
Нормофлоры - биомасса отдельных видов микроорганизмов применяемые для профилактики и лечения дисбактериозов;
Возбудители инфекционных заболеваний - источники антигенов для производства вакцин;
Трансгенные м/о или клетки - продуценты видоспецифичных для человека белковых гормонов, белковых факторов неспецифического иммунитета и т.д.
3) Макроорганизмы
Высшие растения - сырье для получения БАВ;
Животные - млекопитающие, птицы, рептилии, амфибии, членистоногие, рыбы, моллюски, человек;
Трансгенные организмы.
В качестве биологических объектов или систем, которые использует биотехнология, прежде всего, необходимо назвать одноклеточные микроорганизмы, а также животные и растительные клетка. Выбор этих объектов обусловлен следующими моментами:
1. Клетки являются своего рода «биофабриками», вырабатывающими в процессе жизнедеятельности разнообразные ценные продукты: белки, жиры, углеводы, витамины, нуклеиновые кислоты, аминокислоты, антибиотики, гормоны, антитела, антигены, ферменты, спирты и пр. Многие из этих продуктов, крайне необходимы в жизни человека, пока недоступны для получения «небиотехническими» способами из-за дефицитности или высокой стоимости сырья или же сложности технологических процессов.
2. Клетки чрезвычайно быстро воспроизводятся. Так, бактериальная клетка делится через каждые 20-60 минут, дрожжевая - через каждые 1,5-2 ч, животная - через 24 ч, что позволяет за относительно короткое время искусственно нарастить на сравнительно дешевых и недефицитных питательных средах в промышленных масштабах огромные количества биомассы микробных, животных или растительных клеток. Например, в биореакторе емкостью 100 м 3 за 2-3-сут. можно вырастить 10 16 -10 18 микробных клеток. В процессе жизнедеятельности клеток при их выращивании в среду поступает большое количество ценных продуктов, а сами клетки представляют собой кладовые этих продуктов.
3. Биосинтез сложных веществ, таких как белки, антибиотики, антигены, антитела и др. значительно экономичнее и технологически доступнее, чем химический синтез. При этом исходное сырье для биосинтеза, как правило, проще и доступнее, чем сырье для других видов синтеза. Для биосинтеза используют отходы сельскохозяйственной, рыбной, пищевой промышленности, растительное сырье, дрожжи, древесина, меласса и др.).
4. Возможность проведения биотехнологического процесса в промышленных масштабах, т.е. наличие соответствующего технологического оборудования, доступность сырья, технология переработки и т.д.
